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zhuke 2016-12-02 12:30:36

《转》译:PCR扩增的历史及发展

2016-02-22 duyu 转化医学网
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35年前,当GEN开始报道这种相对新的基因工程和分子生物学技术的情况。在当时,GEN是最早知道这种在实验室合成和扩增DNA新方法的公司之一。我们在这里,将通过回顾PCR的引人入胜的历史,来展望未来其在分子诊断领域的成型和发展方向。
  

热情似火

生物科学在空间上很少进步的,他们主要依靠过去的发现来直接或者间接促进我们的了解。在分子生物学领域中,科学家们的贡献使得在过去二十多年中,PCR的功能是分散的。
  

PCR是始于H. Gobind Khorana对遗传密码理解的进步,这导致了DNA寡链核苷酸合成的使用,并在1971年Kjell Kleepe通过对于DNA复制系统的双引物概念得到了进一步的延伸,一直到Fredrick Sanger的测序方法,这种方法为其赢得了1980年的诺贝尔奖,Fredrick Sanger的方法中,其使用了DNA寡聚引物,核苷酸前体和DNA合成酶。
  

这些事前的发现为PCR技术的诞生奠定了基础,然而,如果在回顾PCR技术的时候,不讨论整个反应链的酶-DNA聚合酶,则是一个巨大的错误。1956年,诺贝尔奖得主Arthur Kornberg和他的同事们在大肠杆菌中发现了DNA聚合酶(Pol I)。此外,研究人员描述了这种聚合酶复制DNA模板链碱基序列的过程。然而,科学家们花费了20年,才发现了另一种足够稳定的,可以用于任何实验目的的实验室使用的聚合酶。
  

在1976年,辛辛那提大学的一个研究小组发现了一种聚合酶,其是从极端嗜热细菌中分离出来的,这种水生栖热菌主要生活在温泉和热液喷口处。事实上,这种聚合酶能够忍受通常的蛋白质变性的温度,并且能够在75-80°C附近发挥功能,这奠定了PCR技术的发展。
  

到1983年,所有的分子材料都经准备就绪,就等待适当的组装顺序。当时,诺贝尔奖得主Kary Mullis正在为Cetus Corporation工作,其试图完美的合成寡核苷酸。他偶然的发现了使用多个复制循环和两个引物系统的方法扩增DNA片段的方法,这是在Sanger测序反应的基础上进行了必需的修改和扩大。Mullis发现反应中每一步的温度(融化、退火和扩展)都需要精心的手工控制。此外,他意识到,因为反应使用费耐热性的DNA聚合酶,在每一个成功的循环之后,都需要加入新鲜的酶。
  

Mullis艰苦的工作和坚持终于有了回报,通过两个相反的核苷酸引物分子,某个特定的DNA片段的扩增反应成功的实现了。两年后,Cetus团队在美国人类遗传学协会年会上展示了他们的作品,并且同一年,在《Science》上投稿的文章第一次提到了这种技术;不过,那篇文章并没有详细的说明新开发的PCR技术的具体细节-因此这篇文章被大约15个杂志拒稿,知道1987年才得以发表。
  

虽然科学家们吸收新方法的速度有点慢,但是Cetus的研究人员一直开发改进原有的方法。1986年,科学家们使用耐高温的Taq DNA聚合酶代替了原有的酶,把需要加酶的步骤去除,大大减少了错误率,提高了灵敏度。一年后,PerkinElmer推出了他们的热循环仪,这使得科学家们在PCR反应中可以调节加热和冷却,并获得了更高的效率。
  

在Taq酶和热循环仪推出后不久,PCR反应在研究实验室中获得的指数爆炸级别的发展,其不作用不仅仅限于分子生物学,它还使分子诊断发生了革命,并且这个革命现在还在继续,并没有显示出放缓的迹象。
  

分子工厂

在PCR首次出现之后的很多年,很多重大技术的进步已经广泛的改善了PCR技术。例如,1991年,从嗜热菌激烈火球菌获得的一种新的DNA聚合酶,即Pfu,也被引进了PCR,这种酶相比较于Taq,具有高保真的特性。不同于Taq酶,Pfu建立了3’到5’核酸外切酶活性,这种活性可以使得酶能够校正错误结合的核苷酸-并能够增加碱基的特异性,但是相比较于Taq,有一个速度的减缓。
  

1995年,PCR使用又有了两步进步。第一,即称为抗体“热启动”的PCR,其利用免疫球蛋白分子定向DNA聚合酶并抑制其活性,直到第一个95°C的融化阶段,这个温度会造成抗体变性并使聚合酶具有活性。虽然这个过程能够有效地提高PCR反应的特异性,但是许多研究人员发现,这项技术即耗费时间,而且会经常造成样本的交叉污染。
  

第二个引入的创新是针对分子生物学和PCR方法的。即实时PCR,或者定量PCR(qPCR),其可以使研究人员定量创建用于PCR扩增的DNA模板,即通过使用逆转录酶转录RNA,并结合特定的荧光报告染料来实现。这项技术因为其检测基因表达极其准确,因此被研究人员广泛的使用。在过的20年里,许多公司花费了大量的研发资金来构建一个更准确,更高通量和简单的qPCR机器来满足研究需求。
  

随着新一代测序技术的崛起-这项技术的崛起获得了越来越多研究人员的关注-PCR机器和方法也需要不断现代化以保持同步。在几乎所有的下一代测序反应中出现的PCR仍是关键,但是传统的技术并不需要那么的精确。
  

数字PCR(dPCR)相比较于常规方法则更为细化,第一个真正的商业系统出现在2006年左右。dPCR可以直接量化和克隆扩增DNA或者RNA。
  

设备内一个分区进行一个样本的反应。然而,样本被分割到了大量的分区中。此外,在每个分区中进行的反应使得核酸的检测更为可靠。研究人员经常使用这种方法研究基因序列的变化,如拷贝数变异(CNV),点突变,罕见序列缺失以及microRNA分析,并且可以作为下一代测序技术的样品放大技术。
  

PCR的未来:更好,更快,更强

未来实验室的设置不以某种方式使用PCR时不可能的,尤其是由于下一代测序技术严重依赖于PCR样品的准确性,因此其至少要使用一个方法来见大的放大我们感兴趣的DNA片段。
  

然而至少已经有一种下一代测序技术可以在没有扩增步骤的前提下,识别天然的DNA序列。虽然这种技术在初步实验中表现良好,但是其还在幼年期。这种技术可能会在研究人员发规模采用之前,还需要几年的时间来进行额外的开发完善。即便如此,PCR技术在日常实验室实验中已经变得如此根深蒂固,试图淘汰PCR技术就像要求生物分子雪茄放弃他们的吸量管或者限制性内切酶一样。
  

大多数PCR设备制造商试图寻求不同的方法来提供其热循环的速度和灵敏度,而声学家则希望寻找更好地能够具有更高保真度的DNA聚合酶分子。无论取得什么样的进展,无论他们如何引领生命科学领域,你可以指望,我们能够为我们的读者继续提供详细的信息至少35年。

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